Rhaid bod technoleg PCR wedi syntheseiddio preimio rhesymol a thynnu DNA sampl, ac yna perfformio beicio thermol awtomatig, ac yn olaf perfformio adnabod a dadansoddi cynnyrch. Ar hyn o bryd, dim ond mewn ychydig o sefydliadau ymchwil, sefydliadau a chlinigau sydd â chryfder technegol cryf y gellir cynnal dyluniad a synthesis primer. Nid oes ond angen i'r cais brynu'r pecyn canfod PCR i ddechrau'r gwaith. Mae yna lawer o ffactorau dylanwadu yng nghylchred thermol awtomatig PCR. Ar gyfer gwahanol samplau DNA, mae maint y gwahanol gydrannau a ychwanegir yn yr adwaith PCR a pharamedrau'r cylch tymheredd yn anghyson.
Bellach cyflwynir sawl prif ffactor dylanwadu fel a ganlyn.
Un, paramedrau cylchred tymheredd
Yng nghylchred thermol awtomatig PCR, y ffactor mwyaf hanfodol yw tymheredd dadnatureiddio ac anelio. Fel y dangosir yn yr enghraifft weithredol, amodau dadnatureiddio, anelio ac estyn yw: 94 ℃ 60s, 37 ℃ 60s, 72 ℃ 120s, cyfanswm o 25 ～ 30 A, y darn chwyddedig yw 500bp. Yma, dylid cyfrif amser pob cam ar ôl i'r gymysgedd adweithio gyrraedd y tymheredd gofynnol. Yn y beiciwr thermol awtomatig, mae'r amser o dymheredd gwreiddiol y gymysgedd i'r tymheredd gofynnol yn cymryd 30-60au Mae hyd yr amser oedi hwn yn dibynnu ar sawl ffactor, gan gynnwys y math o diwb adweithio, trwch wal, cyfaint y gymysgedd adweithio, gwres ffynhonnell (baddon dŵr neu floc gwresogi), a'r gwahaniaeth tymheredd rhwng y ddau gam, y dylid ei ddarparu'n ddigonol wrth osod y cylch thermol Rhowch sylw i ac ystyriwch, a dylid gwneud y mesuriad gwirioneddol ar bob offeryn.
Ystyriaeth bwysig arall ynghylch yr amser beicio thermol yw'r pellter rhwng y ddau gysefin; po bellaf y pellter, yr hiraf y mae'n ei gymryd i syntheseiddio hyd llawn y dilyniant targed. Mae'r amser ymateb a roddir uchod yn seiliedig ar y hyd synthesis gorau posibl o 500bp Mae'r dilyniant targed yn cael ei lunio. Dyma gyflwyniad i'r dewis o dymereddau amrywiol.
1. Tymheredd dadnatureiddio templed Mae'r tymheredd dadnatureiddio yn pennu'r tymheredd y mae'r DNA â haen ddwbl yn toddi yn yr adwaith PCR. Os na chyrhaeddir y tymheredd dadnatureiddio, ni chynhyrchir templed DNA un llinyn, ac ni fydd PCR yn cychwyn. Mae tymheredd dadnatureiddio isel yn golygu dadnatureiddio anghyflawn, haen ddwbl DNA Bydd yn aildrefnu'n gyflym, a thrwy hynny leihau'r cynnyrch. Yn gyffredinol 90 ～ 95 ℃. Unwaith y bydd y sampl yn cyrraedd y tymheredd hwn, dylid ei oeri yn gyflym i'r tymheredd anelio. Dim ond ychydig eiliadau y mae dadnatureiddio DNA yn ei gymryd, ac nid yw'n angenrheidiol am amser hir; i'r gwrthwyneb, dylech geisio'ch gorau ar dymheredd uchel. Ei fyrhau i gynnal gweithgaredd polymeras Taq DNA. Ni ddylai'r tymheredd dadnatureiddio uchaf ar ôl ychwanegu Taq DNA polymeras fod yn fwy na 95 ° C.
2. Tymheredd anelio cyntefig Mae'r tymheredd anelio yn pennu penodoldeb a chynnyrch PCR; os yw'r tymheredd yn uchel, mae'r penodoldeb yn gryf, ond os yw'r tymheredd yn rhy uchel, ni ellir cyfuno'r primer yn gadarn â'r templed, a gostyngir effeithlonrwydd ymhelaethu DNA; mae'r tymheredd yn isel, mae'r cynnyrch yn uchel, ond gall rhy isel achosi camgymhariad primer a thempled, Mae cynhyrchion amhenodol yn cynyddu. Yn gyffredinol, dechreuwch gyda'r cyflwr adweithio o 37 ℃, sefydlu cyfres o adweithiau rheoli i bennu'r tymheredd anelio gorau posibl ar gyfer adwaith penodol. Gellir ei gasglu hefyd yn seiliedig ar gynnwys (G + C)% y paent preimio i amgyffred y prawf Mae man cychwyn y prawf cyffredinol, y tymheredd anelio Ta (tymheredd anelio) 5 ℃ yn is na'r tymheredd toddi TTm (tymheredd toddi) y primer ymhelaethu, y gellir ei gyfrifo yn ôl y fformiwla:
Ta = Tm-5 ℃ = 4 (G {{2}} C) {{4}} 2 (A+T) -5 ℃
Yn eu plith, mae A, T, G, ac C yn eu tro yn cynrychioli nifer y seiliau cyfatebol. Er enghraifft, ar gyfer primer o 20 sylfaen, os yw cynnwys (G + C)% yn 50%, gellir gosod man cychwyn Ta ar 55 ° C. Mewn crynodiad primer nodweddiadol (fel 0.2μmol / L), gellir cwblhau'r adwaith anelio mewn ychydig eiliadau, ac nid oes angen anelio tymor hir.
3. Mae'r dewis o dymheredd estyniad primer yn dibynnu ar dymheredd gorau posibl Taq DNA polymeras. Yn gyffredinol 70 ～ 75 ℃, gall cyfradd safonol niwcleotidau wedi'u cataleiddio ensymau yn 72 ℃ gyrraedd 35 ～ 100 niwcleotidau / eiliad. y funud. Gellir ymestyn hyd 1kb, ac mae ei gyflymder yn dibynnu ar gyfansoddiad yr hydoddiant byffer, gwerth pH, crynodiad halen a natur y templed DNA. Os yw'r darn chwyddedig yn fyrrach na 150bp, gellir hepgor y cam estyn, a daw'n gylchred tymheredd deuol, oherwydd Taq DNA Mae'r polymeras yn ddigonol i gwblhau synthesis dilyniannau byr ar y tymheredd anelio. Ar gyfer darnau dilyniant byr rhwng 100 a 300 bp, mae'n effeithiol defnyddio cylch tymheredd deuol cyflym a syml. Ar yr adeg hon, mae'r tymheredd estyniad primer yr un fath â'r tymheredd anelio. Ar gyfer darnau DNA uwchlaw 1kb, gellir rheoli'r amser estyn o fewn 1 i 7 munud yn ôl hyd y darn. Ar yr un pryd, dylid ychwanegu gelatin neu ymweithredydd BSA at y byffer PCR i gadw polymeras DNA Taq yn weithredol ac yn sefydlog am amser hir. Rhyw; Mae glyserol 15% -20% yn helpu i ymhelaethu tua 2.5kb neu ddarnau DNA hirach.
4. Yn gyffredinol, nifer y cylchoedd o PCR confensiynol yw 25 i 40 cylch. Y gwall cyffredinol yw bod nifer y cylchoedd yn ormod, mae'r cefndir amhenodol yn ddifrifol, ac mae'r cymhlethdod yn cynyddu. Wrth gwrs, mae nifer cylchoedd yr adwaith yn rhy fach, ac mae'r cynnyrch yn isel. Felly, mae angen sicrhau bod y cynnyrch yn cael ei sicrhau. O dan ragosodiad y gyfradd, dylid lleihau nifer y beiciau.
Ar ôl cwblhau'r ymhelaethiad, mae'r sampl yn cael ei oeri a'i storio ar 4 ° C.
2. Dylunio Primer Primer
Er mwyn chwyddo templed DNA, yn gyntaf rhaid i chi ddylunio dau gysefin oligonucleotid. Dau ddarn oligonucleotid yw'r hyn a elwir yn mewn gwirionedd sy'n ategu'r dilyniant DNA targed i'w ymhelaethu. Mae'r pellter rhwng y ddau gysefin yn pennu hyd y darn chwyddedig. , Mae pennau 5' dau ben y ddau gysefin yn pennu lleoliad y ddau ben 5' pen y cynnyrch chwyddedig. Gellir gweld mai'r primers yw'r allwedd i bennu hyd, lleoliad a chanlyniadau'r darnau chwyddedig PCR, ac mae'r dyluniad primer yn bwysicach.
Yr amod angenrheidiol ar gyfer dyluniad primer yw bod yn rhaid gwybod y dilyniant DNA targed sy'n ategu'r primer. Nid yw'r dilyniant rhwng y ddau gysefin yn eglur o reidrwydd. Mae'r ddau ddilyniant hysbys yn gyffredinol yn ganolfannau 15-20, y gellir eu syntheseiddio â syntheseiddydd DNA. Yn cyfateb i ddau primer cyflenwol, yn ogystal, mae'r egwyddorion a ddilynir yn gyffredinol mewn dylunio primer yn cynnwys:
1. Mae'r hyd primer yn cael ei gyfrifo yn ôl ystadegau, ac mae'r tebygolrwydd y gall dilyniant oligonucleotid o tua 17 sylfaen ymddangos yn y genom dynol unwaith. Felly, yn gyffredinol nid yw'r hyd primer yn llai na 16 niwcleotid, a'r uchaf Dim mwy na 30 niwcleotid, a'r hyd gorau yw 20-24 niwcleotidau. Ni fydd oligonucleotidau byr o'r fath yn ffurfio hybrid sefydlog ar y tymheredd polymerization (gan basio 72 ° C). Weithiau gall fod yn 5' Ychwanegwch ddilyniannau nad ydynt yn ategu'r templed ar y diwedd, megis safleoedd ensymau cyfyngu neu hyrwyddwyr, i gwblhau clonio genynnau ac anghenion arbennig eraill; gellir defnyddio'r label primer 5' label biotin diwedd neu label fflwroleuol at wahanol ddibenion megis canfod microbau.
Weithiau nid yw'r primer yn gweithio' t, nid yw'r rheswm yn hysbys, gallwch symud y safle i'w ddatrys.
2. Dylai cyfansoddiad (G + C)% primers cynnwys fod yn unffurf, a cheisio osgoi cynnwys yr un polymer sylfaen. Dylai'r cynnwys (G + C)% yn y ddau gysefin fod mor debyg â phosibl, yn y darn chwyddedig hysbys (G + C)% Dylai'r cynnwys fod yn agos at y darn i'w chwyddo, yn gyffredinol Mae 40% i 60% yn well.
3. Dylai y tu mewn i'r paent preimio osgoi ffurfio strwythurau eilaidd amlwg, yn enwedig strwythurau hairpin. Er enghraifft:
4. Ni ddylai fod unrhyw gyflenwad rhwng y ddau gysefin rhwng y primers, yn enwedig ar ddiwedd y 3' Hyd yn oed os na ellir ei osgoi, ni ddylai'r sylfaen gyflenwol 3' fod yn fwy na 2 sylfaen, fel arall mae'n hawdd ffurfio dyfynbris &; primer dimer" Neu" Primer dimer" (Primer dimer). Yn y bôn, mae'r dimer primer, fel y'i gelwir, yn ddarn DNA dwy haen a ffurfiwyd trwy estyn un primer ar y dilyniant primer arall o dan weithred polymeras DNA. , Yn sgil-gynnyrch cyffredin o PCR, ac weithiau hyd yn oed yn dod yn brif gynnyrch.
Yn ogystal, ceisiwch osgoi dilyniannau homologaidd rhwng y ddau gysefin, yn enwedig darnau oligonucleotide gyda mwy na 6 sylfaen union yr un fath, fel arall bydd y ddau gysefin yn cystadlu â'i gilydd am yr un safle o'r templed; yn yr un modd, ni all y primers a'r DNA targed sydd i'w chwyddo Neu ddilyniannau eraill o'r DNA sampl fod â dilyniannau homologaidd o fwy na 6 sylfaen. Fel arall, bydd y paent preimio yn rhwymo i safleoedd eraill, gan leihau ymhelaethiad penodol a chynyddu ymhelaethiad amhenodol.
5. Mae primer 3' diwedd paru polymeras DNA yn ychwanegu niwcleotid sengl i'r 3' diwedd y primer. Felly, rhaid i'r gofynion paru o 5-6 sylfaen o'r 3' diwedd y primer a'r DNA targed fod yn fanwl gywir ac yn llym i sicrhau ymhelaethiad PCR effeithiol. .
Gellir gwirio p'un a yw'r dyluniad primer yn rhesymol trwy chwilio cyfrifiadur gan ddefnyddio meddalwedd PCRDESN a meddalwedd PRIMER Americanaidd.
Yn ddelfrydol, dylid puro oligonucleotidau wedi'u syntheseiddio'n artiffisial trwy gromatograffeg (cromatograffeg) neu TUDALEN i gael gwared ar amhureddau fel cadwyni byr nad ydynt wedi'u syntheseiddio i'w hyd llawn. Gall paent preimio wedi'i buro sy'n cael ei storio mewn toddiant acetonitrile 25% ar 4 ° C atal micro-organebau O dan amgylchiadau arferol, dylid storio paent preimio nas defnyddiwyd mewn oergell ar -20 ° C. Gellir storio'r paent preimio mewn hylif am 6 mis, a gellir ei storio am 1 i 2 flynedd ar ôl lyoffilio.